文｜動脈新醫(yī)藥
近幾年，細胞與基因治療因其驚人的療效，被大眾寄予厚望。同樣，細胞與基因治療背后的核心底層技術(shù)——基因編輯工具，也在近年開始浮出水面，被越來越多的企業(yè)和資本重視。
2022年2月28日，美國專利和商標局（USPTO）裁定，張鋒所在的博德研究所團隊繼續(xù)擁有在真核細胞中使用CRISPR基因編輯工具的專利。“諾獎（以Jennifer和Emmanuelle為代表的團隊）團隊”又一次輸?shù)袅诉@場長達近10年的知識產(chǎn)權(quán)爭奪。針對上述結(jié)果，Jennifer團隊表示將會提起上訴，看來這場長達10年的專利角逐還遠未結(jié)束。
作為醫(yī)療行業(yè)觀察者，動脈新醫(yī)藥也在時刻關(guān)注基于CRISPR技術(shù)的新一代基因編輯工具。對此，我們采訪了國內(nèi)數(shù)家基因編輯工具開發(fā)/細胞與基因治療企業(yè)，聽聽業(yè)內(nèi)科學家們的看法。接下來，你將了解到：
1.作為目前使用最廣泛的基因編輯工具，CRISPR/Cas9是否存在技術(shù)短板？
2.基于CRISPR/Cas9的優(yōu)化，是否為錦上添花？一旦出現(xiàn)專利壟斷，此前的努力會功虧一簣嗎？
3.針對基因編輯工具技術(shù)，國內(nèi)團隊偏向于技術(shù)優(yōu)化還是底層技術(shù)的創(chuàng)新？
4.針對近幾年較熱的CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13，它們的專利布局如何？國內(nèi)企業(yè)為何可以在短期內(nèi)就做出創(chuàng)新性成果？
5.為何大部分企業(yè)針對基因編輯工具的開發(fā)和優(yōu)化都十分“低調(diào)”，從不宣傳？投資機構(gòu)更看重產(chǎn)品進展還是底層技術(shù)？
6.未來，基因編輯工具會朝著哪些趨勢開發(fā)和優(yōu)化？國內(nèi)和國外還存在多少差距？
01 脫靶、安全、編輯效率，都不是痛點
根據(jù)公開資料，我們可以很輕易的歸納出CRISPR/Cas9基因編輯工具本身存在以下幾個痛點：
1、潛在的脫靶風險（脫靶的檢測與控制）。對于潛在的脫靶風險的控制，科研團隊在設計基因編輯工具時，可盡量避免有相似的序列，以免造成序列依賴性?；诖诉M行嚴格的脫靶驗證，就可最大程度避免該風險。
2、切割基因組DNA序列所導致的潛在安全性風險。在此過程中，如果發(fā)生了DNA雙鏈斷裂，可能會引起DNA大片段的缺失，或染色體結(jié)構(gòu)的變化。但通常情況下，大片段的缺失和染色體的異常變化都會導致細胞不容易存活。目前，尚未報道過相關(guān)的安全事件，所以這一問題暫時還沒有影響基因編輯在產(chǎn)業(yè)端的應用推進。
3、對PAM序列的要求，限制了其在基因組上的可編輯范圍。在CRISPR/Cas9靶向DNA進行編輯時，可以實現(xiàn)DNA雙鏈的斷裂。在此基礎上，如果再加上相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，則可以實現(xiàn)某些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。但這些基因的靶向位點會受到PAM序列的限制，從而不能讓基因編輯實現(xiàn)“指哪打哪”的魔力。
4、體內(nèi)遞送系統(tǒng)的設計和搭配。CRISPR/Cas9作為一個基因編輯工具，如何跟體內(nèi)的遞送系統(tǒng)進行有效的搭配，同時保持本身的編輯能力和成藥能力，也是一個需要不斷被優(yōu)化的點。目前CRISPR/Cas9分子量較大，在進行體內(nèi)基因治療需要AAV進行遞送時，AAV裝載量的限制，就要求基因編輯工具的尺寸進一步微型化。
總體來說，不僅是CRISPR/Cas9，所有的CRISPR/Cas蛋白家族或多或少都有自己的優(yōu)點和不足。沒有任何一個CRISPR/Cas基因編輯工具可以完全覆蓋所有的應用場景，如果將CRISPR/Cas9用于敲除某個基因，它已經(jīng)足夠優(yōu)秀。只要能夠做到“術(shù)業(yè)有專攻”，將基因編輯工具用于合適的領(lǐng)域，便可以讓其“發(fā)光發(fā)熱”。
02 錦上添花or功虧一簣？
國內(nèi)團隊基于專利技術(shù)被國外壟斷的CRISPR/Cas9基因編輯工具的優(yōu)化，是否為錦上添花？一旦出現(xiàn)專利壟斷，此前的努力會功虧一簣嗎？
在討論這個問題前，我們需要縷清CRISPR/Cas9的發(fā)展之路，和伴隨發(fā)展延續(xù)至今的專利之爭。
2012年8月，Jennifer團隊在《Science》合作發(fā)表了CRISPR/Cas9領(lǐng)域的里程碑論文；2013年2月，張鋒團隊也在《Science》發(fā)表了論文，文章原始數(shù)據(jù)表明其相關(guān)實驗早于Jennifer團隊。2014年，美國專利商標局率先批準了張鋒團隊所在的博德研究所的專利請求。在此后多次訴訟中，因Jennifer團隊證據(jù)不足，張鋒團隊屢占上風，特別是最具商業(yè)價值的、用于哺乳動物的基因編輯工具專利被張鋒團隊牢牢攥在手中。
2020年10月，諾貝爾評獎委員會公布化學獎獲獎名單，Jennifer和Emmanuelle獲得殊榮，原因是她們開發(fā)了基因編輯工具CRISPR/Cas9。張鋒“痛失諾獎”，引發(fā)熱議。今年2月28日，美國專利和商標局裁定，張鋒所在的博德研究所團隊擁有在真核細胞中使用CRISPR基因編輯工具的專利?！爸Z獎”團隊暫時輸?shù)袅舜舜螌τ谥R產(chǎn)權(quán)的爭奪，但這場超過10年的專利角逐還遠未結(jié)束。
對于CRISPR/Cas9的專利屬權(quán)一直爭議不斷，但很明確的是，CRISPR/Cas9的專利技術(shù)基本屬于國外。
“任何一種技術(shù)，在發(fā)展早期都具有待突破的瓶頸。對于技術(shù)發(fā)明人，他們也需要解決這些瓶頸，才能真正的實現(xiàn)技術(shù)在產(chǎn)業(yè)化端的成功應用。如果國內(nèi)的團隊基于CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)化足夠重大，以至于國外團隊也需要用到我們的‘錦上添花’，就有可能通過專利交叉許可解決技術(shù)的專利壟斷問題。”邦耀生物聯(lián)合創(chuàng)始人兼副總裁李大力博士告訴動脈新醫(yī)藥。
“一般企業(yè)在立項時就會考慮關(guān)鍵技術(shù)的IP屬性這一問題。我們可以看到，CRISPR/Cas9專利權(quán)人在全球范圍內(nèi)都向很多企業(yè)提供了商業(yè)化授權(quán)許可，包括技術(shù)服務和藥物開發(fā)等各個方向。企業(yè)需要向?qū)＠钟蟹街Ц妒跈?quán)費或達成授權(quán)許可協(xié)議，便可以應用相關(guān)技術(shù)。另一方面，CRISPR/Cas9技術(shù)也在持續(xù)創(chuàng)新和改進，衍生的這些技術(shù)也能產(chǎn)生巨大的商業(yè)價值?！比痫L生物創(chuàng)始人梁峻彬博士告訴動脈新醫(yī)藥。
關(guān)于轉(zhuǎn)讓或許可技術(shù)給其他公司進行開發(fā)，從而帶來收益，相關(guān)的例子并不缺乏。例如日本微生物組基因編輯療法公司Bio Palette從神戶大學獲得了使用nickase Cas9進行單堿基編輯的專利的許可，做了一系列創(chuàng)新并獲得了收益，這一技術(shù)就屬于對CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)化。再例如Bio Palette與Beam公司就堿基編輯技術(shù)進行了交叉許可（獲得Beam許可），Bio Palette因此從中獲益。
“在工業(yè)界，美國的基因編輯企業(yè)在成立之初就會優(yōu)先考慮其底層IP是否清晰。對于國內(nèi)的早期企業(yè)而言，依靠團隊或平臺優(yōu)勢就能夠獲得資本和市場的認可。隨著企業(yè)的發(fā)展，基于技術(shù)優(yōu)化的一定積累，開發(fā)原始創(chuàng)新的技術(shù)更有利于促進企業(yè)長遠和自由發(fā)展?！陛x大基因創(chuàng)始人兼CEO姚璇博士告訴動脈新醫(yī)藥。
基于業(yè)內(nèi)人士的認知，我們不妨看得更“開”。如果一項技術(shù)確實具有重大的價值，那它其實很難被個別機構(gòu)所壟斷。這種壟斷只會埋沒高技術(shù)的價值，不利于其科研和商業(yè)價值的放大。不管在學術(shù)界還是產(chǎn)業(yè)界，都需要大量的持續(xù)創(chuàng)新才會使得這個技術(shù)的本身的社會價值和商業(yè)價值越來越大。
03 技術(shù)優(yōu)化or底層創(chuàng)新？
盡管國內(nèi)大多企業(yè)認為基于CRISPR/Cas9的技術(shù)優(yōu)化并不會出現(xiàn)功虧一簣的情況。但是當動脈新醫(yī)藥問及企業(yè)目前偏向于基于國外專利技術(shù)進行優(yōu)化還是自主研發(fā)實現(xiàn)底層創(chuàng)新時。企業(yè)們還是“口嫌體正直”的統(tǒng)一選擇了更為艱難的底層創(chuàng)新。
李大力博士說道：“邦耀生物做了許多堿基剪輯器的開發(fā)，并在2020年就開發(fā)了一系列超高活性的新型胞嘧啶堿基編輯器（命名為：hyCBE），相關(guān)成果已在線發(fā)表于Nature Cell Biology。至今，它仍然是活性最高的胞嘧啶堿基編輯器（最高可提升20倍活性），其編輯窗口較傳統(tǒng)編輯器也有明顯擴增，能編輯到更多的位點。更重要的是，這種改造方法具有兼容性，它不僅適用于改造胞嘧啶堿基編輯器，其他堿基編輯器同樣適用于這個方法，在基因治療等領(lǐng)域已展示出非常廣闊的應用前景。
同年6月，邦耀生物團隊又在國際著名學術(shù)期刊Nature Biotechnology發(fā)文，開發(fā)出全新的雙堿基編輯系統(tǒng)，這項成果不僅是堿基編輯工具開發(fā)領(lǐng)域的又一重大突破，也為基礎研究和遺傳性疾病如β-地中海貧血的治療提供了新的發(fā)展方向和工具。針對上述提到的堿基編輯器，邦耀生物已申請了多項專利，并進行了全球化布局?！?/p>
梁峻彬博士說道：“瑞風目前針對CRISPR/Cas系列工具酶進行了開發(fā)。在Cas13方面我們率先進行了專利布局。瑞風開發(fā)的新型蛋白對特定RNA靶核酸的編輯活性優(yōu)于目前最常用的高活性CasRx，且脫靶效應更低。其中一高活性Cas13的尺寸比CasRx小約70aa，更有利于AAV遞送，在成藥上具有極大的優(yōu)越性。此外，新的Cas12亞型也是瑞風正在開發(fā)的方向。我們還對某些Cas12蛋白進行了工程化改造，目前也已經(jīng)取得了不錯的成果，顯著提高了野生型參比蛋白的活性，且不受Cas12亞型專利壁壘限制?！?/p>
姚璇博士說道：“輝大科學家團隊在2020年通過數(shù)據(jù)計算分析開發(fā)了兩類新型CRISPR/Cas13 RNA編輯系統(tǒng)，2021年在《Nature Methods》發(fā)表了相關(guān)文章，介紹了我們?nèi)绾卧诓煌臄?shù)據(jù)庫中篩選蛋白，進而獲得高的RNA編輯器。這兩年間，我們對Cas13進行了許多改造和優(yōu)化，得到了特異性強、脫靶性低的高保真版本hf-Cas13蛋白，在動物實驗中已經(jīng)取得了積極的有效性和安全性試驗數(shù)據(jù)。Cas12Max是輝大子品牌HuiEdit科學家團隊在去年開發(fā)的新型DNA編輯器，目前經(jīng)過優(yōu)化后的Cas12蛋白在體外和體內(nèi)都能實現(xiàn)與spCas9相當?shù)腄NA編輯效率。同時，團隊還在繼續(xù)優(yōu)化其PAM識別區(qū)，以進一步擴大Cas12的靶向序列范圍。針對CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13，輝大均已申請相應的全球?qū)＠⒆隽说讓訉＠牟季??；谶@些成果，輝大正在積極和國內(nèi)外多家企業(yè)洽談專利許可、聯(lián)合開發(fā)等相關(guān)合作。”
為何國內(nèi)的基因編輯企業(yè)們會在近幾年頻頻爆出底層技術(shù)的創(chuàng)新？究其原因，主要有三。
其一，在CRISPR/Cas9基因編輯工具技術(shù)剛剛面世時，不管是企業(yè)還是科研機構(gòu)，都還處于了解和學習的歷程。那時候國內(nèi)的團隊們本身對新工具的認知還處于不斷深化和積累的狀態(tài)，只能對底層技術(shù)進行優(yōu)化。這一階段對應國內(nèi)的2013年至2018年，屬于CRISPR/Cas9基因編輯工具技術(shù)在國內(nèi)發(fā)展的第一個五年。
其二，在積累到足夠經(jīng)驗時，國內(nèi)的團隊基于此前優(yōu)化的創(chuàng)新點得出通用的底層邏輯，或者是開發(fā)基因編輯工具的相關(guān)經(jīng)驗。通過技術(shù)遷移或者是技術(shù)兼容，初步探索新型基因編輯工具。該階段對應國內(nèi)的2018年至今。
其三，縱觀整個基因編輯工具的發(fā)展歷史，我們可以發(fā)現(xiàn)人類對于自然界微生物的了解還是冰山一角。仍然有大量的編輯工具可以持續(xù)不斷的發(fā)掘。沿著高度優(yōu)化或原創(chuàng)性技術(shù)開發(fā)的方向前進，就能一直對現(xiàn)有基因編輯工具進行局部創(chuàng)新和迭代創(chuàng)新。
關(guān)于基因編輯工具的底層創(chuàng)新，其實國內(nèi)企業(yè)早就有所布局。近幾年，關(guān)于CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13基因編輯技術(shù)的相關(guān)成果頻頻爆出。在眾多的家族蛋白中，為何會是CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13率先“出圈”？其實這并沒有什么特定的原因。
這主要由于，相比于CRISPR/Cas9“密不透風”的專利保護范圍，CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13具有巨大的專利布局空間。
從基因編輯工具本身來講，CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13與CRISPR/Cas9都使用了Cas家族蛋白，相關(guān)工具也都具有簡便、高效的優(yōu)點（相比于ZFN、TALEN技術(shù)）。一些CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13系統(tǒng)相比于CRISPR/Cas9還具有尺寸更小便于AAV和質(zhì)粒遞送、PAM差異化序列、無需tracrRNA、編輯策略設計靈活等差異特性。
此外，CRISPR/Cas13基因編輯工具靶向RNA，提供了RNA水平的一種編輯手段，具有高度的靶向特異性，在非遺傳性疾病的藥物開發(fā)方面具有巨大的商業(yè)價值。這與CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12作用在DNA水平的成藥策略是不一樣的。CRISPR/Cas13其中的RNA敲降成藥策略方面與化學修飾小核酸的作用類似，后者是基于化學合成路線的原理。業(yè)內(nèi)人士認為，CRISPR/Cas13RNA編輯工具的應用，在未來也將會找到獨具優(yōu)勢的適應癥或者應用場景。
總體來說，Cas家族蛋白的真正應用，一般需要挖掘發(fā)現(xiàn)和序列優(yōu)化：
首先，要在TB級的豐富數(shù)據(jù)庫中，通過AI、生物信息學、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)學等綜合分析，找尋潛在功能性蛋白。
其次，要在野生型的蛋白基礎上進行各種序列的優(yōu)化，改造和修飾。對于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13等家族，野生型蛋白都有一定的局限性，科學家也是對它們的序列進行優(yōu)化和改造，來提高它們的編輯效率、PAM序列識別區(qū)域、特異性以及降低脫靶效應、優(yōu)化編輯工具的大小等。
04 投資機構(gòu)還需被“教育”
底層技術(shù)和產(chǎn)品管線同等重要
通過上述篇幅，我們能夠看出基因編輯工具就像是細胞與基因治療行業(yè)的奠基石，只有不斷的開發(fā)和優(yōu)化基因編輯工具，細胞與基因治療產(chǎn)業(yè)才能走得更遠。但是我們也能發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，國內(nèi)大部分企業(yè)針對基因編輯工具的開發(fā)和優(yōu)化都十分“低調(diào)”，從不宣傳。造成這一現(xiàn)象的原因有三：
首先，每家企業(yè)都有自己的形象定位和宣傳的偏向性。對于宣傳基因編輯工具，還是細胞與基因治療管線，企業(yè)選擇自由。
其次，大部分該領(lǐng)域的企業(yè)覆蓋到產(chǎn)業(yè)端時，大家可能更傾向于將顯性的藥品本身的里程碑進展對外進行宣傳，從而增強企業(yè)的品牌影響力和對投資人的吸引力。
再而，要想做到真正的底層創(chuàng)新，并不是一件易事。例如針對CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13的開發(fā)，目前一般都是先篩選野生型Cas12/Cas13蛋白，但野生型蛋白一般難以兼顧用作藥物治療時的安全性、有效性、免疫原性、脫靶等，而需要做一定的工程化改造。能做到這類工作的國內(nèi)企業(yè)少之又少。尤其是大部分初創(chuàng)企業(yè)，在資金和人才的雙重匱乏下，沒有進行底層創(chuàng)新的實力和時間。大多數(shù)企業(yè)會選擇在推進管線研發(fā)的過程中，順便做一些技術(shù)創(chuàng)新。
未來，新型的CAS蛋白或者是基于現(xiàn)有CAS蛋白的開發(fā)和優(yōu)化，大體會朝著活性更高、脫靶風險更小、PAM識別范圍更廣、尺寸更小、分子組合應用創(chuàng)新等方向發(fā)展。
另一方面，在歐美生物醫(yī)藥行業(yè)，初創(chuàng)企業(yè)可以輕松憑借一個新的蛋白或一項新的技術(shù)，得到投資人的認可，從而獲得不菲的融資。從國內(nèi)投資現(xiàn)狀來講，大部分投資人則更看重藥物本身的進展。在這一點上，國內(nèi)的投資人還需要被持續(xù)教育：底層技術(shù)是公司未來發(fā)展的基石。
隨著行業(yè)的不斷向前，投資人們也在不斷接受新知識的洗禮。越來越多的在關(guān)注產(chǎn)品時，也會特別關(guān)注一些具有真正含金量技術(shù)的藥物研發(fā)企業(yè)。雖然不同的投資人判斷產(chǎn)品和技術(shù)的權(quán)重比例不同，但是這兩者之間本身就是相輔相成的關(guān)系。產(chǎn)品是成功技術(shù)的體現(xiàn)和放大，技術(shù)是產(chǎn)品研發(fā)的根基和后盾。